大曲微生物研究与应用

　　自20世纪60年代起我国就对酿酒微生物进行了研究和应用工作，特别是20世纪80年代成绩尤为突出，大力促进了酿酒业的发展。中国微生物学会等于1981年和1988年分别在江苏双沟和山东泰安召开了全国酒曲微生物学术讨论会，对推动我国酿酒微生物研究和发展起了重要作用。

　　对大曲微生物分离、选育和应用，全国各名优酒厂如茅台、泸州老窖、汾酒、西凤、洋河、双沟、沱牌、白云边、景芝、四特等及大专院校、科研单位都做了大量工作。

　　1957-1960年对茅台酒曲、酒醅进行微生物分离鉴定，确认茅台酒曲中芽孢杆菌最多，鉴定的17株枯草芽孢杆菌中有5株产生黑色素，用此菌制曲也生成茅台酒曲的香味。

　　茅台试点还对堆积糟醅中的微生物进行了检验，证实高温堆积是相当于二次制曲，堆积糟中的微生物主要是来自麦曲、晾堂、空气等，其微生物绝大多数是酵母。

　　20世纪80年代初贵州省轻工业科学研究所从茅台曲中分离出菌株95株，其中细菌47株、霉菌29株、酵母19株，认为嗜热芽孢杆菌是茅台酒生产有益菌类，它与其他菌起着重要而复杂的作用。利用茅台酒酿造过程中分离出的芽孢杆菌，再混入河内白曲、拟内孢霉、红曲霉、根霉、异常汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母等制曲，生产麸曲酱香型白酒，如迎春酒、黔春酒等被评为国家优质酒，这是微生物研究的重要成果。

　　20世纪60年代汾酒试点对汾酒大曲的微生物进行了检测，发现汾酒曲中曲块表面根霉居多，梨头霉在大曲中含量最多，少许黄曲霉、黑曲霉和毛霉；红曲霉在清茬曲中较多；曲中乳酸菌较多，醋酸菌较少。将选育出的有效微生物l1种制成麸曲，生产出六曲香酒，被评为国家优质酒。

　　1964年中科院西南生物研究所与四川省食品研究所和泸州曲酒厂合作，从泸曲中分离出酵母和霉菌253株，选取其中32株菌分别制成麸曲和液体曲（酵母），投入生产，减少大曲用量，试验窖的酒保持了泸州大曲酒特有的风味。

　　1983年中科院成都生物研究所在四川汉源酒厂，采用“强化菌优质曲”、“人工厌氧菌强化窖”两项微生物技术，收到明显效果。1985年，四川省食品发酵工业研究设计院与仙潭酒厂合作再次对浓香型大曲制曲过程中的微生物进行研究，发现微生物的主要来源及曲坯培养过程中的变化规律。1986年该院与沱牌曲酒厂等合作，对浓香型曲酒酿造过裎中产酯酵母的生态分布进行了系统研究，并选育出产酯量达700mg/lOOmL以上的产酯酵母，并在清香、浓香型酒生产中推广应用，效果显著。

　　酿造发酵过程中微生物的研究

　　茅台试点曾对茅台酒窖内发酵糟的微生物进行了研究，发现窖内发酵糟微生物的变化相当复杂，开始酵母很多，以后慢慢减少，但发酵糟在堆积期间若感染大量细菌，则下窖后细菌显著增加。1965年泸州试点项目中，对泸州大曲酒发酵过程中的微生物进行连续三排检测，了解粮糟在发酵过程微生物类群的变化规律，入窖后第三天酵母达到最高峰，以后逐渐下降，霉菌封窖后数量急剧下降，到发酵中期数量回升，出窖前数量又减少，而细菌则在整个发酵过程中变化幅度较小。汾酒、洋河、双沟、宝丰等对酿酒发酵过程中微生物的变化也都做过实地查定。微生物的变化与香型、地区、季节、工艺、发酵温度等关系很大。

　　酿酒功能菌的选育应用

　　1．根霉的选育及应用

　　从事工业微生物研究的前辈方心芳与乐华爱于1959年提出：“小曲的根霉是八百年来培养的良种，可分四川型与上海型，糖化力都很强，即3.852、3.868从四川小曲样中获得，3.866、3.867从上海小曲样中获得。”这两类根霉都有很强的糖化力，都具有糖化和酒精发酵的功能。上海型根霉在发酵过程中产酸能力强，适于酿造薯类原料；川黔型根霉产酸很少，适于高梁原料发酵。这些优良菌种数十年来都在全国推广应用。

　　近年，江苏洋河酒厂与江南大学生物工程学院合作，从洋河大曲中分离到一株华根霉(R92)，可发酵产酯化酶，经选育后，己酸乙酯合成酶的活力高，同时具有高酸、高酒精度下高产己酸乙酯的能力，对稳定和提高新型白酒口感十分有效。应用R92华根霉6%，己酸8%，黄水35%，曲粉6%，食用酒精20%以下，酒尾10%，人工窖泥10%，酒糟5?%，发酵酯化60d，经特殊工艺脱水浓缩而成的特殊调味酒，微量成分十分丰富，是很好的调味酒。

　　2．利用微生物自动鉴定系统分析酿酒功能菌

　　近年来一些名酒企业和科研机构，购置了微生物自动分析系统，对酿酒功能菌进行鉴定，该系统到现在已经能鉴定包括细菌、酵母、丝状真菌在内的近2000种微生物。内蒙古农业大学生物工程学院、中国食品发酵工业研究院、新疆大学生命科学与技术学院从牛栏山酒厂红曲中分离到一株细菌，采用Biolog微生物自动分析系统鉴定为地衣芽孢杆菌。

　　地衣芽孢杆菌在白酒发酵过程中具有较高的分解蛋白质能力，产生浓郁酱香物质5-羟基麦芽酚，是白酒发酵中一种较重要的菌种。微生物自动分析系统在酿酒工业中应用，将为研究中国白酒发酵机理、风味物质的形成，增加了新的手段。

　　3．太空酒曲功能菌的研究

　　利用返回式空间飞行器，将微生物送入太空，在地面难以模拟的空间环境下，促使菌种的基因发生变异，取得地面上无法获得的诱变效果，并且在返回地面后进行培育、筛得到生产性能优良的微生物菌种，应用于生产。陕西喜登科技股份有限公司白水杜康生产基地的酿酒搭载神舟4号飞船（简称太空酒曲），于2003年1月5日返地，中科院成都生物所对其中功能菌进行了分离、选育及生物学特征方面的研究，并与原生产中使用的曲药进行对比。发现曲药经太空诱变育种后，其功能菌的活性发生了很大改变，根霉和黑曲霉的糖化酶、液化酶活性均比未上太空对照菌株高出2～3倍，黑曲霉的蛋白酶活性也提高了l～2倍。但该研究未见在白酒生产中实际应用的效果报道。

　　4．酯化酶的进一步研究

　　20世纪90年代，许多单位对红曲酯化酶进行了大量的研究，并应用于生产。此后，酿酒工作者对其他具有酯化能力的菌种从多方面进行了探讨，江南大学研究了华根霉对己酸的酯化，四川理工学院研究了黄曲霉对已酸的酯化。他们从泸州老窖“久香”牌大曲中分离得到1株产己酸乙酯酯化霉的黄曲霉。在液体发酵培养基中，36℃、150r/min恒温振荡培养72h，发酵液酶活力可达6.75u/mL。对该菌株产酯化酶的培养条件进行研究，以黄豆粉为氮源，淀粉为碳源，初始pH6.0，36℃培养72h，酶活可达9.16u/mL。该项菌株应用于生产，未见进一步报道。

　　5．芝麻香型白酒和浓香型白酒微生物的研究

　　芝麻香型白酒是传统酱香型白酒基础上的创新与发展，由于用曲和工艺的独特，酒醅中微生物菌群亦独具特点。江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室等对浓香型白酒窖池发酵的全过程跟踪取样，借助于PCR -变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16SrRNA基因文库两种方法，对比研究了江苏地区浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物菌群结构。研究发现，白酒的品质不仅与生产工艺相关，还与地理环境、水质、气候和粮食等因素密不可分。不同地域、不同的生产工艺都会导致发酵过程中微生物菌群结构的演变产生差异，利用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE和构建克隆文库技术分析了江苏北部某酒厂浓香型和芝麻香型白酒窖池酒醅在发酵过程中原核生物的菌群结构和变化规律，与四川某浓香型白酒发酵窖池中糟醅样品的DGGE分析结果比较，发现四川浓香型白酒酿造，人窖发酵一周后，酒醅中微生物多样性就已急剧减少，仅观察到一条明显的电泳条带，这种现象一直到发酵结束。而江苏窖池酒醅发酵近1个月后细菌群落才出现这种情况。这可能与入池发酵温度有关，四川18℃入窖，微生物繁殖速度较快，氧气被迅速消耗，致好氧细菌逐渐消亡；而苏北入窖温度仅12℃，氧气消耗、微生物繁殖和消亡都较慢，到发酵后期才出现相类似的现象。同时，通过16S rRNA基因克隆文库的测序和比对，不仅鉴定出在白酒曲药和酒醅的研究中尚未报道的细菌属，而且显示出不同地区同一种香型白酒中微生物区系存在巨大差异。同一地区不同香型酒醅中微生物的群落亦有很大不同。运用PCR - DGGE基因指纹图谱技术分析白酒曲药和酒醅中的微生物群落结构，研究传统食品发酵功能微生物的生态特征与规律，将其与传统的菌种分离鉴定和白酒固态发酵检测等手段相结合，对判断和鉴定白酒生产中与特征风味物质相关的关键微生物，指导生产工艺改进，具有重要的理论和实践意义。

　　四川大学食品工程系与生物工程系合作，利用基于16S rDNA的克隆分析技术，对发酵60d的浓香型白酒窖池糟醅中原核微生物多样性的分析发现，糟醅中分布的原核微生物既有细菌又有古菌，其在系统发育树图上分成7个分枝：低(G+C) mol%革兰阳性菌、高(G+C) mol%革兰阳性放线菌、革兰阴性拟杆菌群、革兰阴性变形杆菌群、革兰阳性纤毛菌群、TM7门和产甲烷古细菌群。这些菌群数量多、分类上分布广，具有复杂的代谢多样性，能生成多种活性物质及降解复杂有机物，其代谢产物在窖池特定的环境下通过复杂的生理生化反应能形成浓香型白酒的特征风味因子。

　　综合利用分子生物学分析方法以及常规菌类分离鉴定方法，加强对固态法发酵白酒酒醅微生物菌系分析，特别是对一些尚未报道的酿酒微生物菌株的系统发育和生理特性认识，对深入研究酿酒微生物的分布特征和形成规律，以及在白酒风味形成上的作用具有重要的理论指导意义。

　　6．白酒微生物资源的发掘与应用

　　中科院成都生物研究所多年来开展了白酒工业微生物资源的发掘与应用。

　　(1)利用甲醇的生丝微菌的发现与分离，可降低白酒中甲醇含量。

　　(2)分离了高乙醇浓度特殊环境中甲烷氧化菌。

　　(3)从浓香型老窖中分离出一株产甲烷杆菌，开发出甲烷细菌与己酸菌共酵的二元发酵技术。

　　(4)从泸州老窖泥中分离出产己酸的细菌，应用于人工培窖。

　　(5)杂醇油利用菌的发现与分离，为酒精工业降低杂醇油提供了新途径。

　　(6)从郎酒高温曲中分离得到一株嗜热芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌），该菌在90℃高温时具有强的活性，糊精化淀粉作用温度高达lOO℃，产酶条件pH4.5~10.0。

　　(7)从泸酒麦曲中分离出一株红曲霉，用于制强化曲。